1.吸干或甩干孔內反應液；

2.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）；

3.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1～2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；

4.吸干孔內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；

5.重復操作步驟3和4，洗滌3～4次（或按說明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。

微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。

洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%～0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。

流水沖洗法*初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續沖洗2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。

已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。

主要的參數是洗滌量。自動洗板機會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調為高，*好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應孔的洗滌量必須相同。

ELISA試劑盒的使用手冊中列出包被量。我們建議使用350μl洗滌液進行洗滌，以便清潔整個反應孔的壁。一般來說，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。

影響洗滌效果的主要參數是洗滌循環的量。當然，洗滌次數越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會降低信號強度，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復洗滌三次。不過，一般而言，包被平板需要的洗滌次數比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板，必須優化洗滌次數。

控制洗滌量和洗滌次數的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說，96孔板的每個孔能容納330至460 μl。不過，有些自動化洗板機可設置程序，分配遠遠超出這個量的洗滌液，比如1 ml。它是如何做到的呢？其實很簡單，就是在分液的同時打開吸液功能。換句話說，隨著分液器分配更多的液體，抽吸器也將液體吸出。這種技術能增加洗滌量，但不會溢出到其他孔中。

還有一些參數會影響洗滌步驟的效果。這些參數包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調整，以降低背景（殘留量）和差異。

殘留液體中包含未結合的抗原或抗體，它們會增加背景信號。殘留量越小，殘留液體越少，轉移到下一步的干擾液體也就越少。

吸液高度會明顯影響殘留量；如果洗滌吸頭與反應孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應孔底部，那么也會使吸液效率降低，殘留量增加。

目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動，而剛性洗頭則固定在適當的位置。使用剛性洗頭的洗滌操作在優化起來更為復雜，因為你需要非常仔細地調整吸液高度。如果你們實驗室使用幾種不同的板，那可能會很耗時。在使用浮動洗頭時，吸頭會降到反應孔的底部。調整高度就不是很重要，因此洗頭會下降到底部。

抽吸的位置也對殘留量有著重要影響；如果每個孔只使用一個抽吸點（這很常見，因為更快），那么抽吸的位置需要優化。*佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應孔的中間，即使這是所有洗頭*常見的默認位置。一般來說，*佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。

反應孔的形狀也會影響殘留量。C形底（平底圓角）的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。